Окраска по Граму: методика и теоретическое объяснение

По сложности работы методы окраски фиксированных (неживых) клеток разделяются на:

1. Простые методы. В этом случае используют только одну краску, как правило, красную (фуксин) или синюю (метиленовый синий). Разница между этими красителями состоит в скорости воздействия. Фуксин дает результат уже через 1-2 мин., тогда как результат работы синей краски нужно ждать 3-5 мин. Использовать раствор фуксина в карболовой кислоте (т. н. фуксин Циля) удобно еще и потому, что приготовленный препарат в течение нескольких месяцев не теряет окрашивающих свойств. Метиленовый синий краситель тоже может быть подготовлен заранее в крепком спиртовом растворе.
2. Сложные (дифференциальные) методы. Здесь потребуется несколько красителей (минимум два), имеющих различный цвет. Это позволит не просто увидеть бактерии, но и подробнее изучить их внутреннее строение, так как различные участки клетки могут по-разному воспринимать красители. К сложным относят методы Грама, Циля – Нильсена (для кислотоустойчивых бактерий), Бениньетти (окраска бактериальных жгутиков), Гинса (выявление капсул), дифференцирующий метод Романовского – Гимзы (окраска спор) и некоторые другие.

Дифференцирующий способ Романовского – Гимзы основан на применении специального готового порошка, на основе которого лаборатории готовят раствор красителя нужной концентрации. Преимущество этого способа в том, что цитоплазма и ядро клетки получают различную окраску, что облегчает идентификацию и изучение микроорганизмов.

Метод Нейссера используют в медицине для обнаружения зерен волютина (гранул с запасом пищи для многих прокариотических клеток) у возбудителей дифтерии. В результате окрашивания бактерия приобретает желтый цвет, а гранулы волютина – синий.

Техника проведения окрашивания

Окраска по Граму относится к сложному способу окрашивания, когда на мазок влияют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обезбарвлюючи вещества: спирт, кислоты и др. Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметанового группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалл виолет. Грам-положительные (грамм (+)) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительном окраске фуксином Грамм (+) микроорганизмы не меняют сначала присоединен фиолетовый цвет.

Грамотрицательные (грамм (-)) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом соединения, легко разрушается под действием спирта. В результате микробы обесцвечиваются и потом окрашиваются фуксином, приобретая красного цвета.

Подготовка материала для окраски

Материал исследуемого распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация

При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убиты микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положена действие высокой температуры на клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации Стекло с препаратом берут пинцетом и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют таким приемом: свободную от мазка поверхность стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильной фиксации стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущение ожога (70-80 ° С).

Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96% и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96% — 60%, хлороформа 30%, ледяной уксусной кислоты 10 %). Стекло с высушенным мазком погружают в стакан с фиксирующей веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания

1. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2-3 минуты. Чтобы избежать осадка красят через фильтровальную бумагу.
2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором, по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) в почернение препарата.
3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96 ° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок НЕ обесцветится и жидкость стекает, не станет чистой (примерно 20-40-60 секунд).
4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
5. Для выявления грамотрицательных бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранина (2-5 мин).
6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Окраска мазков по Wright-Giemsa (№ 9990710)

На основе эозинатов полихромного метиленового синего

1. Погрузить предметные стекла в раствор красителя Райт-Гимза на выбранное время (примерно 60 секунд). Не взбалтывать краситель!

2. Осушить или промокнуть свободную часть предметного стекла (или стеклодержатель), чтобы удалить избы ток краски.

3. Погрузить предметное стекло в буферный раствор примерно на то же самое время, что и время в красителе (60 секунд). Увеличение или уменьшение времени пребывания мазка в краске или буфере будет менять окончательный цвет препарата.

4. Осушить или промокнуть свободную часть препарата (или стеклодержатель), чтобы удалить избыток бу фера.

5. Погрузить мазок в раствор очистителя на 2-10 секунд, быстро взбалтывая.

6. Протереть обратную сторону стекла.

7. Высушить окрашенный мазок в вертикальном положении, поставив на адсорбирующую поверхность (напри мер, на фильтровальную бумагу). Не промокать мазок!

8. Нанести каплю масла и исследовать мазок под микроскопом. Результаты: как при окрашивании по Романовскому.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР — метод, в основу которого положен процесс естественной репликации ДНК, осуществляемый в клетках.

ПЦР позволяет обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК среди большого количества других молекул вирусного и клеточного происхождения.

Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:

— ДНК-мишени (ДНК, которую необходимо амплифицировать).

— Праймеров — пар олигонуклеотидов, протяженностью от 15 до 30 нуклеотидных пар (нп), комплементарных к соответствующим участкам ДНК-мишени. Корректно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

— Taq- полимеразы — термостабильного фермента, достраивающего вторую цепь ДНК по одному из тяжей ДНК-мишени.

— Дезоксинуклиотидтрифосфатов дНТФ — дезоксиаденозинтрифосфат дАТФ, дезоксигуанозинтрифосфат дГТФ, дезоксицитозинтрифосфат дЦТФ и дезокситимидинтрифосфат дТТФ. Эти компоненты используются Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

— Буферного раствора (БР), обеспечивающего оптимальные условия для реакции.

ПЦР включает в себя три температурных этапа:

— Первый этап состоит из процесса денатурации ДНК, находящихся в образце, в результате денатурации одна двухцепочечная молекула ДНК переходит в две одноцепочечные молекулы. Температурный режим ТР — 92-95 °С.

— Второй этап заключается в гибридизации (присоединении) праймеров к комплементарным участкам ДНК-мишени; этот процесс носит название отжига праймеров. ТР — 55-60 °С.

— Третий этап ПЦР включает в себя синтез второй цепи на одноцепочечной молекуле ДНК-мишени, на которой произошел отжиг праймеров. ТР на этом этапе соответствует оптимальным условиям работы Taq-полимеразы и равен примерно 70-74 °С.

Если трехэтапный температурный цикл многократно повторить (30—40 циклов), то количество амплифицированных молекул ДНК-мишени (ампликонов) достигнет приблизительно 2 (где п число циклов амплификации). Необходимо отметить, что процесс накопления продуктов амплификации идет по геометрической прогрессии лишь определенное число циклов, а затем имеет место эффект «плато», то есть количество ампликонов не возрастает.

Детекцию ампликонов выполняют методами электрофореза или с помощью ДНК-ИФА. В настоящее время на рынке существует система DASH, которая позволяет выявлять ампликоны, используя совершенную систему ДНК-ИФА (дополнительная информация по запросу).

Организация ПЦР лаборатории требует специального оборудования (ламинары, настольные центрифуги, термостаты, пипетманы и т. д.) и специально оборудованных и корректно расположенных помещений (для предупреждения контаминации).

Метод in situ RT-PCR был разработан с целью соединения высокой чувствительности метода реакции об ратно — транскриптазной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) с преимуществами исследований in situ, что особенно важно, например, для вирусов с низким уровнем репликации. Как и ISH. in situ RT-PCR состоит из нескольких этапов: подготовка биологического материала, in situ амплификация, обнаружение внутриклеточньи продуктов RT-PCR. In situ RT-PCR. Необходимое оборудование: термоциклер PCR Express (№-HB-PX-B05) со сменным блоком для предметных стекол или самостоятельный прибор Omnislide (№ HB-OS-BB-220), который позволяет целиком решить технологиче кие задачи приготовления образцов

Необходимое оборудование: термоциклер PCR Express (№-HB-PX-B05) со сменным блоком для предметных стекол или самостоятельный прибор Omnislide (№ HB-OS-BB-220), который позволяет целиком решить технологиче кие задачи приготовления образцов.